사상처방의 구성 본초는 『동의수세보원 신축본』(이하 신축본)을 바탕으로 구성되었으며, 신축본의 구성 본초의 명명은 사상체질별 본초 선별 및 네트워크 약리학 데이터베이스와의 연관성을 탐색한 이전 연구10를 참조하였다. 이 연구에서는 소음인, 소양인, 태음인의 경우 배11,12,13의 연구를 기본으로 삼았으며, 태양인의 경우 김14의 연구를 참고하였고 여기에 본초의 포제 사항까지 고려된 명칭도 추가로 수기 조사하여 최종 본초 리스트를 선정하였다.

사상체질처방 구성 본초의 성분정보는 네트워크 약리학 데이터베이스 중 하나인 ‘TM-MC’15에서 확보했다. TM-MC는 크로마토그래피(Chromatography) 방식으로 검출할 수 있는 한약 성분에 대한 포괄적인 성분정보를 제공해주는 데이터베이스이며, 성분에 대한 정보를 표준 명칭 중 하나인 ‘pubchem compound ID’를 제공해주는 특성이 있다. 한글 명칭을 기준으로 ‘TM-MC’에서 사상처방의 구성 약물을 검색하였으며, 검색된 정보를 바탕으로 사상처방의 본초-성분 연결 관계를 추출하였다.

Huang 등16이 여러 데이터베이스를 종합하여 천연물에 대한 다양한 직·간접적 표적 정보를 정리하여 구축한 데이터 세트와, 문헌, 실험적 근거 등을 포함한 다양한 데이터베이스를 종합하여 40만개 이상의 성분에 대한 표적 정보를 통합 제공하는 ‘Search Tool for Interactions of Chemicals(STITCH)’17, 그리고 이미 알려진 표적정보와 질환 관련 표적 및 신호전달경로 등을 제공하는 ‘Therapeutic Target Database(TTD)’18 데이터베이스 들을 활용하여 실험적으로 검증된 성분-표적 상호작용의 정보를 파악하였다. 단백질 명명체계의 통일을 위해, ‘STITCH’의 ‘ensemble protein ID’는 ‘gene symbol’ 및 ‘entrez gene ID’로 변환했다.

처방-단백질-표적으로 단순히 연결 짓는 네트워크 약리학적인 분석 시에는, ‘어떤 처방 내 여러 성분과 상호작용하는 특정 표적’과 ‘또 다른 처방 내 단지 하나의 성분과 작용하는 특정 표적’이 단순하게 동등한 관계로 취급되므로 해당 특정 표적에 대해 두 처방에 동등한 정도로 작용한다고 해석하게 되는 문제가 발생할 수 있다. 이를 해결하기 위해 저자들은 각 사상처방 별 단순 경로의 수를 계산 후, 그 결과를 바탕으로 각 처방 별로 단순 경로의 숫자가 높은 상위 100개의 표적들을 선별하였다. 만일 처방의 표적들이 100개가 넘지 않는 경우 이들 모두를 주요 표적으로 간주하였다. 단순 경로는 네트워크상에서 출발 노드(node)에서 연결 노드까지의 다다를 수 있는 경로의 개수를 의미하므로, 단순 경로의 숫자가 높다는 것은 특정 표적에 대한 처방의 영향력이 상대적으로 강하다는 것을 뜻한다. 100개라는 기준은 한약 연구에 있어서 도출된 다양한 성분 및 한약들을 활용하여 연구했던 Zhang 등19, Wang 등20의 연구를 참조하였다. 이 과정에서 주요 표적의 선택이 사상처방에 내재된 사상체질 별 분류 정보에 미치는 영향을 탐색하기 위하여, 모든 표적을 포함했을 경우와 100개 이하의 표적으로 군집(cluster)을 구축한 경우를 서로 비교해보았다.

Ruiz 등9의 제안에 따라 다계층 상호작용 네트워크를 구축하기 위하여 단백질-단백질 상호 작용의 경우, ‘Biological General Repository for Interaction Datasets’21, ‘Database of Interacting Proteins’22, 그리고 ‘Human Reference Protein Interactome Mapping Project’23 등 에서 얻어진 17,660개의 단백질 간에 387,626개의 연관 관계를 수집하였다. 그리고 ‘Gene Ontology’에서 인간에게 존재하는 단백질-생물학적 기능 상호 작용에 대한 7,993개의 단백질과 6,387개의 생물학적 기능 사이의 34,777개의 연관 관계를, 그리고 생물학적 기능간 상호작용의 경우 9,798개의 생물학적 기능 간에 생성되는 22,545개의 연관 관계를 수집하였다. 마지막으로 질병-단백질 상호 작용의 경우, ‘DisGeNet’24에서 얻어진 840종의 질병과 25,212개의 연관 관계를 수집하였다.

Ruiz 등9은 약물이나 질병이 인체 다계층 상호작용 네트워크상에 미치는 영향을 이해하기 위하여 확산 프로파일(diffusion profile)을 계산하였다. 이 확산 프로파일은 기본적으로 랜덤워크(Random walker) 알고리즘을 바탕으로 계산된다. 이 알고리즘은 특정 단백질의 기능 및 유전자의 기능을 예측25하는데 사용되거나, 소셜 네트워크 분석26, 웹 페이지 랭킹 분석27, 추천 시스템 개발 등의 IT 분야에서도 사용되며, 복잡한 네트워크에서 단일 노드의 영향의 정도 및 전파효과를 추론하는데 활용되는 그래프 기반의 알고리즘이다. 기본적인 랜덤워크 알고리즘은 네트워크에서 단일 노드 및 복수의 노드를 시작점으로 주변의 노드 중 하나로 무작위로 동일한 확률에 따라 이동하거나, 조건 상 다시 초기 노드로 돌아가 재 시작하는 방식으로 진행되나 본 연구에서는 생물학적인 현상에 대한 정확한 예측을 위해, 특정 노드에서 인접한 단백질 및 생물학적 기능으로 나아갈 확률이 서로 다른, 치우친 랜덤워크(biased random walk with restart) 알고리즘을 사용하였다. 이전 연구는 특정 노드에서 단백질보다 생물학적 기능으로 이동할 확률이 1.5배가량 높을 때 약물의 치료효과 예측에 최적의 성능을 발휘한다는 것을 제시하였다. 결국 이러한 치우친 랜덤워크 알고리즘이 충분히 반복적으로 수행되어, 더 이상 각 노드의 방문 빈도가 변하지 않을 정도가 될 정도로 수렴하면 탐색 과정은 종료된다.<br> 탐색과정이 종료된 후 다계층 상호작용 네트워크를 구성하는 각 노드의 영향력을 벡터로 정의하고 변환하기 위해 해당 단백질이 약물의 표적이거나 질환 관련된 단백질이면 1, 아니면 0으로 정의하게 되며 현재 노드에서 다음 노드로 이동할 상대적 확률이 표현된 ‘biased transition matrix’를 곱해주게 된다. 이 연산을 통해 랜덤 워크의 알고리즘 상 k번째 방문할 확률 상태에서 k+1번째 상태로 옮겨갔을 때의 확률을 도출할 수 있다. 이 과정은 ‘transition matrix’를 곱해도 더 이상 그 방문 빈도의 차이가 미리 정해진 허용 오차(tolerance parameter)보다 더 크지 않을 때까지 반복된다. 이러한 반복 연산과정으로 얻어진 특정 약물이나 질환에 연관된 각 노드의 방문빈도가 바로 확산 프로파일로 정의된다. 즉, 확산 프로파일은 처방에 대한 표적, 질환에 관련된 표적과 같은 관심 단백질군의 단백질과 생물학적 기능, 이들 간 상호작용으로 구성된 다계층 상호작용 네트워크 상의 전파 효과를 측정한 값을 포함하고 있는 개념이다. 약물의 확산프로파일과 질병의 확산 프로파일을 각각 확보한 후, 두 확산프로파일 간의 피어슨 상관 계수(Pearson correlation coefficient)를 계산하여 약물과 질병 사이의 연관성을 정량적으로 파악하였다. 상관점수가 높은 처방-질환 쌍은 네트워크 상 질환 관련 단백질로 인한 영향과 사상처방에 포함된 단백질 군의 영향이 밀접한 관련성을 보인다는 것으로, 그 질환을 해당 처방이 효과적으로 작용할 수 있는 질환으로 고려할 수 있다는 것을 의미한다. 본 연구에서는 특정 질병에 대해 사상처방이 본 연구방법에 의해 어떻게 추천되는 지를 확인하기 위해 2022년 발간된 사상체질병증 임상진료지침28에 제시된 주된 질환인 비만과 당뇨병에 대한 추천 처방을 탐색해보기로 했다. 또한 임상진료지침에 제시된 처방이 어느 순위에서 나타나는지 확인해보았다.

비만과 당뇨병에 대한 추천 사상처방 중 1순위 처방과 함께 임상진료지침에 추천된 처방에 대해 본 연구방법이 어떻게 사상처방이 특정 질병에 작용하는 핵심 기전을 제안하는 확인해보았다. 확산 프로파일에서 각 벡터의 구성원소의 값은 특정 약물 표적 혹은 질환 관련 단백질을 시작점으로 다계층 상호작용 네트워크의 노드에 랜덤 워커가 방문한 빈도이므로, 이 값이 큰 단백질 혹은 생물학적 기능은 특정 약물 혹은 질환에 의해 영향력을 많이 받은 요소라고 가정할 수 있다. 그러므로 각 약물 또는 질병에 대해 상위 20번 째 방문 빈도가 높은 영향력 있는 노드들만을 선택하여 이들만의 네트워크를 별도로 구성했다. 상위 20번째의 선택기준은 이전 연구5를 참조하였다. 질병 관련 단백질 또는 생물학적 기능에 연결되지 않은 약물이나, 반대로 특정 약물에 연결되지 않은 단백질 및 생물학적 기능은 선택에서 제외하였다.

신축본에 등장한 사상처방은 총144개(소음인 47개, 소양인 37개, 태음인 44개, 태양인 16개)로 조사되었다. 이 처방들을 구성하고 있는 본초 중 성분 정보가 없거나 성분 정보가 있어도 그 성분의 표적이 없는 본초를 제외하였다. 그 결과, 유효한 생체표적을 갖는 80종 본초를 확인하였다(Figure 1A). 각 본초 별 표적 개수는 다양했는데(Figure 1B), 태음인 본초에 해당하는 오매(烏梅)가 1071개, 백과(白果)가 632개 등으로 표적이 가장 많았으며, 소음인 처방에 포함된 당귀(當歸)가 587개, 인삼(人蔘)이 491개, 그리고 소양인 처방에 포함된 시호(柴胡)가 286개, 금은화(金銀花)가 255개의 표적을 가지고 있는 것으로 나타났다. 반면, 표적이 확보된 본초 중 60% (소음인 20개, 소양인 15개, 태음인 12개, 태양인 1개)가 100개 이하의 표적을 가지는 것으로 나타났다.<br> 선택된 본초에 대한 정보를 활용하여 구축된 네트워크는 62개의 처방, 80개의 본초, 248개의 성분, 2643개의 표적과 이들 간의 총 연결 관계 8,272로 구성되었다(Figure 2, Supplementary Table 1). 소음인의 경우 24종의 처방, 32종의 본초, 128종의 성분, 1,671종의 표적과 이들 사이의 4,035개의 상호 연결이 있었다. 소양인의 경우, 16종의 처방, 26종의 본초, 91종의 성분, 1,107종의 표적과 이들 사이의 2,578개의 상호 연결이 있었다. 태음인의 경우, 20종의 처방, 21종의 본초, 79종의 성분과 1,855종의 표적, 그리고 이들 사이의 3,953개의 상호 연결이 있었다. 태양인의 경우 2종의 처방, 1종의 본초, 1종의 성분, 26종의 표적과 28개의 상호 연결이 있었다.

본초 별 표적 정보를 활용하여 처방 별로 포함되어 있는 표적의 개수를 측정한 결과, 각 처방의 평균 표적 개수는 912.4개였으며, 많은 표적을 가지고 있는 표적은 2,297개의 표적을 갖은 우황청심원이었고, 순서대로 2,054개의 표적을 갖는 팔물군자탕, 2,013개 표적을 갖는 승양익기부자탕, 2,011개 표적을 갖는 인삼관계부자탕 등이 있었다(Figure 3-A).<br> 또한 처방 별 군집을 구축한 결과, 모든 표적에 대한 정보를 활용한 기본 설정(defalt setting)일 때에 비해, 단순경로가 많은 순위에 따라 표적의 개수를 100개로 한정할 때 군집들에 체질별 처방들이 더 잘 모이는 경향성이 있었다. 특히, 소음인의 경우 기본 설정에서는 소음인에 대한 사상처방이 4개의 군집으로 분리되어 있었으나, 표적을 100개로 한정하게 되면 파두단 하나의 처방을 제외하고는 모든 처방이 하나의 군집으로 할당되어 모이게 되었다(Figure 3-B).

표적이 확보된 62종 사상체질 처방과 ‘DisGeNet’에서 확보된 840종 질환과의 모든 연결 조합은 52,080쌍으로 확인되었으며 각 질환에 대해 우선적으로 활용될 수 있는 사상체질처방을 파악하기 위하여, 모든 처방-질환 쌍에 대한 확산프로파일 사이의 상관관계 점수를 계산한 후 점수가 높은 순서대로 처방-질환 쌍을 나열하였다(Supplementary table 2). 질환에 대해서 높은 상관점수를 가지는 사상처방은 해당 질환에 우선적으로 활용될 가능성이 높은 것을 나타낸다. 해당 연구결과에서 비만(UMLS disease ID: C0028754 /Obestiy)로 검색한 경우, 파두단이 0.012로 가장 상관관계 점수가 높았으며, 녹용대보탕, 조위승청탕, 태음조위탕, 마황정통탕이 0.011로 그 뒤를 이었다. 이처럼 임상진료지침에서 제안된 태음조위탕은 상관관계 점수 2순위에 해당하였다. 당뇨병(UMLS disease ID: C0011849 /Diabetes mellitus)로 검색한 경우에는 숙지황고삼탕과 십이미지황탕이 0.008로 가장 상관관계 점수가 높았으며, 이어 우황청심원과 공진흑원단이 0.007로 뒤를 이었다(Table 1). 하지만 임상진료지침에서 당뇨병 치료에 사용할 수 있다고 권고된 청폐사간탕(열다한소탕 가 고본, 대황)은 신축본에는 제시되지 않는 처방명이었으므로 본 연구에서 구축한 처방데이터베이스에 수록이 안되었으므로 상관관계 점수를 확인할 수 없었다.

앞서 비만 및 당뇨병에 대해 높은 상관관계를 보인 처방에 대해 표적과 질환 관련 단백질 사이의 핵심 기전을 규명하고자 하기 위해 비만과 파두단 혹은 당뇨병과 숙지황고삼탕 및 십이미지황탕에 대한 상위 20번 째까지 방문 빈도가 높은 영향력 있는 노드들만을 이용해서 다계층 상호작용 네트워크를 별도로 구성하였다(Figure 4). 먼저 비만의 제1순위 처방으로 제시된 파두단의 경우 비만 관련 단백질인 CNR1에 직접적으로 영향을 미치고, 간접적으로 HTR1A과 HTR2B을 경유하여 G 단백질과 연계된 신호전달체계를 통해 비만 관련 단백질인 INS와 APOE에 영향을 끼쳐 비만에 대한 치료효과를 나타내는 것으로 예측되었다(Figure 4A). 다음으로 임상진료지침에 제시된 태음조위탕의 경우 비만 관련 단백질인 PTGS2, PPARA, TNF에 직접적으로 영향을 미칠 수 있었으며, 간접적으로는 PKM, TP53, RELA, MAPK1, TGFB1, MC4R를 경유하거나 단백질 인산화(protein phosphorylation), DNA 전사과정이나 RNA 중합효소 II에 대한 활성 혹은 억제 기전으로 비만관련 단백질에 영향을 미칠 수 있는 것으로 예측되었다(Figure 4B). 한편 당뇨병의 제1순위 처방으로 제시된 숙지황고삼탕의 경우 당뇨병 관련 단백질인 LMNA과 SIRT1에 직접 영향을 끼치고 있으며, 간접적으로는 JUN, RELA, ABL1, MAPK8, TGFB1, TP53, TRAF6를 경유하거나, RNA 중합효소II의 전사 조절을 활성화시키는 방식으로 당뇨병을 조절하는 것으로 예측되었다. 또 다른 1순위 처방인 십이미지황탕은 당뇨병 관련 단백질인 LMNA, PTGS2를 직접 조절하고 EGFR, TNF, ABL1, RELA, MAPK8, AKT1를 경유하며 RNA 중합효소II의 전사 조절을 활성화시키는 방식으로 당뇨병 치료에 효과를 보이는 것으로 예측되었다(Figure 4C).