보명지주 본초 리스트는 이 등이 이전에 활용한 방법을 따랐다17. 먼저 이제마가 저술한 『동무유고』에 제시된 본초들 중 보명지주와 연관된 본초을 선별하였다18. 그러나 『동무유고』에는 태양인의 편소지장과 연관된 보명지주 본초는 정의되어 있지 않기 때문에, 부득이하게 『동의수세보원』에서 제시된 태양인 처방인 오가피장척탕(五加皮壯脊湯)과 미후등식장탕(獼猴藤植腸湯)에 포함된 공통 본초들로 보명지주 본초를 정의하였다. 이러한 선별 과정은 저자인 사상의학 전문의 1인이 진행하였다.

본 연구에서는 한약재의 성분 정보를 수집하기 위해 한국한의학연구원에서 운영하는 OASIS 한의학 지식베이스(https://oasis.kiom.re.kr/index.jsp)를 활용하였다 (OASIS reference). OASIS 플랫폼의 ‘생리화학(Physicochemical)’ 섹션에서 한약재의 물리화학적 성분 데이터를 추출하였으며, 총 478종의 한약재로부터 16,117개의 화합물을 확보하였다. 단백질 표적 데이터는 이전 연구와 유사한 방식으로 확보하였다19. 구체적으로, 화합물-표적 상호작용은 실험적으로 검증된 데이터를 기반으로 하였으며, DrugBank20, Therapeutic Target Database(TTD)21, Search Tool for Interactions of Chemicals(STITCH)22, Huang 등23의 연구 등 신뢰할 수 있는 출처에서 데이터를 수집하였다. 이 중 DrugBank 데이터베이스는 약물-표적 정보에 대한 포괄적인 데이터를 제공하여, 알려진 및 잠재적인 표적, 관련 질환, 생물학적 경로, 해당 단백질을 표적으로 하는 약물 정보를 제공한다. 또한 STITCH는 여러 출처에서 43만 개 이상의 화합물에 대한 표적 데이터를 통합하였다. Huang 등의 연구는 자연 유래 화합물과 단백질 간의 직접적 및 간접적 상호작용 데이터를 제공하였다. 단백질 명명체계의 통일을 위해, ‘STITCH’의 ‘ensemble protein ID’는 ‘gene symbol’ 및 ‘entrez gene ID’로 변환했다.

각 보명지주 본초의 표적 중 본초에 의한 영향력이 높은 표적 만을 선별하기 위하여 본초 별 단순 경로의 수를 계산 후, 그 결과를 바탕으로 각 본초 별 단순 경로의 숫자가 높은 상위 50개의 표적들만 선별하였다. 단순 경로란 네트워크상에서 출발 노드(node)에서 연결 노드까지의 다다를 수 있는 경로의 개수를 의미하므로, 단순 경로의 숫자가 높다는 것은 특정 표적에 대한 본초의 영향력이 상대적으로 강하다는 것을 뜻한다. 만일 단일 본초의 표적들이 50개가 넘지 않는 경우 이들 모두를 주요 표적으로 간주하였다. 50개라는 기준은 한약 연구에 있어서 도출된 다양한 성분 및 한약들을 활용하여 연구했던 Zhang 등24, Wang 등25의 연구를 참조하였다.

보명지주 본초들의 주요 표적과 관련된 생물학적 기능을 심층적으로 조사하기 위해 농축 분석(Enrichment Analysis)을 수행하였다. 이를 위해 Python의 GOATOOLS 라이브러리를 활용하여 Gene Ontology Biological Process 용어를 추출하였다. 특히, 면역관련 기능을 수집하기 위하여 ‘Immune System Process (GO: 0002376)’의 모든 하위 용어 567개의 용어를 수집하였다. 이러한 용어들은 면역 관련 생물학적 프로세스를 대표하며, 연구의 초점을 면역 체계에 맞추는 데 활용되었다. 수집된 567개의 용어 중 Enrichr에서 분석을 제공하는 용어를 선정하였다. Enrichr (http://amp.ph arm.mssm.edu/Enrichr/)은 입력된 유전자 목록을 기반으로 Gene Ontology, KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 등 다양한 유전자 집합 라이브러리를 활용하여 풍부도 분석을 수행하는 도구이다26. 이 도구는 adjusted p-value, z-score, combined score와 같은 통계적 결과를 제공하여 유전자 목록과 관련된 생물학적 기능을 파악하는 데 도움을 준다. 최종적으로 선정된 122개의 면역 관련 GO 용어를 사용하여 보명지주 본초들의 주요 표적 유전자들이 어떤 면역 과정에 관여하는지 분석하였다.

본 연구에서는 23개의 보명지주 본초에 대한 인체 표적을 분석하여, 420개의 표적과 1,000개의 상호작용으로 구성된 네트워크를 구축하였다 (Figure 1). 각 사상의학 체질별로 표적이 확인된 본초를 포함하여 다양한 생리적 과정에 미치는 영향을 분석하였다. 소음인의 경우, 당귀 (Angelicae Gigantis Radix), 백출 (Atractylodis Rhizoma Alba), 인삼 (Ginseng Radix), 감초 (Glycyrrhizae Radix et Rhizoma), 진피 (Citri Unshius Pericarpium), 천궁 (Cnidii Rhizoma), 작약 (Paeoniae Radix) 7개의 약물이 포함되었다. 소양인의 경우, 목단피 (Moutan Radicis Cortex), 목통 (Akebiae Caulis), 복령 (Poria Sclerotium), 산수유 (Corni Fructus), 숙지황 (Reh- manniae Radix Preparata), 지모 (Anemarrhenae Rhizoma), 황백 (Phellodendri Cortex) 7개의 본초가 포함되었다. 태음인의 경우, 맥문동 (Liriopis seu Ophiopogonis Tuber), 흑사당 (Saccharum Nigrum), 석창포 (Acori Graminei Rhizoma), 오미자 (Schisandrae Fructus), 우황 (Bovis Calculus), 황금 (Scutellariae Radix) 등의 본초 6개가 포함되었다. 마지막으로, 태양인의 경우 오가피장척탕과 미후등식장탕의 공통 본초들 중 표적 정보가 제공되는 본초는 노근 (Phragmitis Rhizoma), 목과 (Chaenomelis Fructus), 오가피 (Acanthopanacis Cortex) 3개로 파악되었다. 본 네트워크는 사상의학 체질에 맞춘 보명지주 본초의 분자 메커니즘을 이해하기 위한 기초를 제공하며, 이후 분석의 기초로 활용되었다.

보명지주 본초들의 표적 군과 122종의 면역 관련 생물학적 기능(biological function)간의 관련성을 탐색을 수행하였다. 우리는 모든 보명지주 관련 본초들과 유의미하게 관련된(FDR p-value <0.05) 면역 관련 생물학적 기능의 수가 무작위 확률(chance level, α = 0.05 기준 6.1개)을 초과하는 것을 확인하였다. 평균적으로, 보명지주 본초는 18.56개의 면역 관련 term들과 유의미한 관련성을 연관되어 있으며, 이는 무작위 확률(chance level, FDR p-value 기준, 6.1개)보다 약 3배 높은 수준을 보였다. 이 결과는 보명지주 본초와 면역 관련 기능 간의 연관성이 무작위 확률을 초과함을 나타내며, 이들 본초가 면역 조절에 있어 기능적 역할을 할 가능성을 시사한다.

한편 사상의학 체질별 보명지주 본초의 면역 관련 용어(term)의 분포는 다음과 같았다. 소양인의 경우 평균 26.1개의 관련 용어가 나타났으며, 특히 지모 (43개), 숙지황 (40개), 목단피 (36개) 등이 높은 연관성을 보였다. 다음으로 태양인의 경우 평균 26개의 관련 용어가 확인되었고, 오가피 (38개), 모과 (31개), 노근 (7개) 등의 본초가 포함되었다. 태음인은 평균 21개의 관련 용어가 포함되었으며, 우황 (27개), 오미자 (23개), 황금 (23개) 등이 해당되었다. 마지막으로, 소음인의 경우 평균 17.3개의 관련 용어가 연관되었고, 백출 (24개), 감초 (24개), 진피 (18개) 등이 높은 연관성을 보였다. 이 결과는 각 체질의 보명지주를 보강하는 특정 본초들이 면역 기능과 밀접하게 연관되어 있음을 보여주며, 사상체질의 개념이 면역력이라는 개념과 연관되어 있을 가능성을 뒷받침한다.

각각의 사상체질에서 본초가 면역 기능 카테고리에 미치는 절대 빈도와 상대적 비율을 비교하여, 체질별 보명지주 본초와 면역기능 대분류 별 연관성을 분석하고자 하였다.

먼저 절대 빈도 차트에서는 각 체질에서 보명지주 본초가 특정 면역 기능에 관련된 횟수를 보여준다 (Figure 3 왼쪽). 주목할 만한 면역 기능은 Leukocyte Activation과 Immune System Process로, 두 기능은 대부분의 사상체질에서 상대적으로 높은 빈도로 관찰되었다. 예를 들어, Immune System Process는 소양인에서 183회, 소음인에서 121회, 태음인에서 107회, 태양인에서 78회로 분포가 가장 높은 것으로 나타났다. Leukocyte Activation의 경우, 소양인에서 가장 높은 빈도(77회)를 보였으며, 다른 사상체질에서도 유사하게 관찰되었다. 반면, Somatic Diversification of Immune Receptor나 Antigen Processing and Presentation과 같은 기능은 거의 관측되지 않았다. </br>다음으로 상대 비율 차트는 각 면역 기능 카테고리에서 사상체질 별 비율을 비교한다 (Figure 3 오른쪽). 먼저, Immune System Process는 모든 체질에 걸쳐 유사한 비율로 분포되어, 특정 체질에 편중되지 않았다. 이는 보명지주 본초가 기본적인 면역 기능을 모든 체질에서 골고루 지원하는 특성을 나타낸다. 한편, Regulation of Immune System Process 및 Positive Regulation of Immune System Process 두 가지 카테고리는 소양인과 태양인에서 상대적으로 높은 비중을 차지했다. Regulation of Immune System Process는 소양인에서 32%, 태양인에서 28%로 나타났으며, Positive Regulation of Immune System Process 역시 유사한 비율로 소양인과 태양인에서 높은 비중을 보였다. 또한, Leukocyte Migration과 Leukocyte Activation 기능은 태음인에서 상대적으로 높은 비중을 보였다. Leukocyte Migration은 태음인에서 33%, Leukocyte Activation은 30%로, 태음인의 보명지주의 본초의 효과는 백혈구 이동 및 활성화와 밀접한 관련이 있음을 보여준다. 마지막으로, Immune Response는 소음인에서 상대적으로 높은 비중인 32%를 차지했다. 이러한 결과는 보명지주 본초가 전반적으로 면역기능과 관련되면서도, 체질 별로 서로 다른 면역기능과 연관성이 있음을 시사한다.

사상체질 별 관련 면역기능을 파악하기 위하여, 보명지주 본초에 포함되어 있는 표적을 바탕으로 농축분석(enrichment analysis)를 수행하였다. 먼저 소음인에서 통계적으로 유의한 (FDR Adjusted p < 0.05) 면역 기능 4개를 확인하였다 (Table 1). 주목할 만한 면역 기능으로는 Microglial Cell Activation과 Macrophage Activation이 있었으며, 두 기능은 소음인에서 상대적으로 높은 빈도로 관찰되었다. 구체적으로, 소음인 표적 중 IFNG, AZU1, MAPT, TNF가 Microglial Cell Activation과, IFNG, AZU1, MAPT, TNF, TLR4 등이 관련된 Macrophage Activation 과 관련된 것으로 나타났다. 이 외에도, T-helper 17 Cell Differentiation, Antimicrobial Humoral Response 기능도 소음인 보명지주 본초의 표적과 유의미한 관련이 있는 것이 나타났다.

다음으로 소양인에서 통계적으로 유의한 (FDR Adjusted p < 0.05) 면역 기능 22개를 확인하였다 (Table 2). 주목할 만한 면역 기능으로는 MyD88-dependent Toll-Like Receptor Signaling Pathway, Microglial Cell Activation, Macrophage Activation 등이 있었으며, 이들은 소양인에서 상대적으로 높은 빈도로 관찰되었다. 또한, IRAK1, TRAF6, TLR4가 관련된 MyD88-dependent Toll-Like Receptor Signaling Pathway, IL4, APP, AZU1, TNF가 관련된 Microglial Cell Activation, IL4, APP, AZU1, TNF, TLR4 등이 관련된 Macrophage Activation 역시 유의미하게 관련된 것으로 나타났다. 이 외에도, T-helper 17 Cell Differentiation, Toll-Like Receptor 4 Signaling Pathway 기능도 소양인 보명지주 본초의 표적과 유의미한 관련이 있는 것으로 나타났다. </br>다음으로 태음인에서 통계적으로 유의한 (FDR Adjusted p <0.05) 면역 기능 15개를 확인하였다 (Table 3). 주목할 만한 면역 기능으로는 microglial cell activation과 Macrophage Activation이 있었으며, 두 기능은 태음인에서 상대적으로 높은 빈도로 관찰되었다. Microglial cell activation 역시 유의미하게 관련된 것이 확인되었으며, 관련 유전자는 IL4, ITGAM, IFNG, MAPT, JAK2, AIF1, TNF였다. 또한, T-helper 17 Cell Differentiation과 T-helper Cell Differentiation도 태음인에서 유의미하게 나타났다.

T-helper 17 Cell Differentiation은 Overlap 3/8로 IL6, STAT3, RORC 유전자와 연관되었으며, T-helper Cell Differentiation은 IL4, IL6, KMT2A, GPR183, RORC 유전자가 관여하였다. 그 외에도, T-helper 2 Cell Differentiation은 IL4, KMT2A 유전자가 관련되었으며, Myeloid Leukocyte Mediated Immunity는 IL6, PLA2G1B 유전자가 관여하여 유의미한 결과를 보였다. Innate Immune Response in Mucosa와 Neutrophil Mediated Immunity 등도 태음인 보명지주 본초의 표적과 유의미한 관련이 있는 것으로 나타났다. </br>마지막으로 태양인에서도 통계적으로 유의한 (FDR Adjusted p < 0.05) 면역 기능을 7개를 확인하였다 (Table 4). 주목할 만한 면역 기능으로는 Myeloid Leukocyte Mediated Immunity와 T-helper 17 Cell Differentiation이 있었으며, 이들은 태양인에서 상대적으로 높은 빈도로 관찰되었다. 또한, IL6, PLA2G1B가 관련된 Myeloid Leukocyte Mediated Immunity, IL6, STAT3가 관련된 T-helper 17 Cell Differentiation이 유의미하게 나타났다. 이 외에도, Neutrophil Mediated Immunity, Innate Immune Response in Mucosa, mucosal Immune Response, B Cell Activation, B cell receptor signaling pathway, T cell differentiation 등의 기능도 태양인 보명지주 본초의 표적과 유의미한 관련이 있는 것으로 나타났다.