garlic acid, 3.5-dinitrosalicylic acid, Alumi- nium nitrate, Quercetin, Folin-Denis reag- ent, Griess`s reagent for nitrite (ACS급) sigma에서 benzo[a]pyrene 및 3-methylchol- nthrene 표준물질을 구입하여 사용하였으며, 나머지시약은 GR급 시약을 사용하였다.

재료로 사용한 마늘은 서산 육 쪽 마늘을 구입하였다.

시판되는 서산 육 쪽 마늘을 구입하여 통마늘 뿌리를 제거하고 꼭지부분은 위로 약 2㎝만 남기고 잘라서 준비 하였다. 마늘을 고온으로 처리하기 위하여 15kg/cm2이상의 압력에서도 견딜 수 있으며, 안전을 위하여 일정한 압력이상이 발생하면 자동으로 압력을 배출하는 장치와 압력을 측정할 수있는 장치를 제작하여 사용하였다. 시료는 내부용기에 통마늘 10통씩 넣은 후 일정량의 물이 첨가된 가압용기에 넣어 흑마늘을 제조 하였다. 처리방법으로는 가압용기를 일정한 온도(110℃, 120℃ 및 130℃)로 가온된 oil bath에서 6hr, 12hr, 24hr, 48hr 처리 후 사용하였다.

각 시료의 열수 추출물은 고온 처리한 시료 10g에 증류수 100㎖를 가하여 90℃ 수욕 상에서 환류 냉각 시키면서 2시간씩 2회 반복 추출하였고, 95% 에탄올 추출물은 열수추출물과 동일한 방법으로 70℃ 수욕 상에서 환류냉각 시키면서 2시간씩 2회 반복 추출한 후 감압 여과한 여액을 회전식진공농축기를 이용하여 농축 후 일정용량으로 한 후 냉장고(4℃) 보관하여 사용하였으며, 시료의 변질 방지를 위하여 최대한 신속한 실험을 진행하였다.

Folin-Denis[22]법을 이용하여 시료추출물 0.4㎖, 증류수 3.0㎖, Folin-Ciocalteu 시약 0.2㎖, Saturated Na₂CO₃용액 0.4㎖, 첨가 후 1시간 방치하여 725㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 Galic acid를 농도별(10~100㎍/㎖)로 제조하여 검정곡선을 작성하였으며, 이에 기초하여 폴리페놀 함량을 정량하였다. 추출물의 총 폴리페놀 함량은 g 당 ㎎ gallic acid로 나타내었다.

환원당은 DNS법을 이용하여 증류수 7.0㎖, 시료 추출물 1.0㎖, DNS시약 2.0㎖ 혼합 후 water bath(100℃)에서 5분 중탕 후 냉각하여 520㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 glucose를 농도별(1000~3000㎍)로 제조하여 검정곡선을 작성하였으며, 이에 기초하여 환원당 함량을 정량하였다.

Moreno법[23] 이용하여 플라보노이드용 시료 추 출물 0.3㎖, aluminium nitrate(10%) 0.1㎖ 1M potassium acetate 0.2㎖, methanol (80%) 4.4㎖를 혼합 후 실온 40분 방치한 후 415㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 quercetin을 농도별(10~200 ㎍)로 제조하여 검정곡선을 작성하였으며, 이에 기초하여 플라보노이드 함량을 정량하였다.

아질산염 소거능 측정은 Kato 등[24]의 방법으로 농도별로 희석한 시료 희석액 2.0㎖에 1mM NaNO₂ 1.0㎖을 넣은 다음 0.1N HCl을 이용하여 pH 1.2로 조정한 후 증류수를 첨가하여 반응용액의 부피를 10.0㎖로 하였다. 이 용액을 37℃에서 1시간 반응시킨 후 반응용액 1.0㎖을 취하여 2% acetic acid 5.0㎖와 Griess reagent(1% sulfanilic acid : 1% naphthylamine = 1:1 in 30% acetic acid) 0.2㎖를 가한 후 vortex하여 실온에서 15분간 방치 후 520㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조 구는 Griess reagent 대신 증류수를 가하여 측정하였으며, 아질산염 소거능은 아래와 같이 계산하였다.

A : Griess 시약에 시료 첨가 후 흡광도 측정

B : 시료대신 증류수 사용하여 흡광도 측정

C : Griess 시약 대신 증류수 첨가 후 흡광도 측정

식약청 생약의 벤조피렌시험방법을 변형하여 실험하였다. 처리한 시료 10.0g과 내부표준액 1.0㎖를 첨가하여 95% 알코올을 사용하여 2회 환류 추출한 용액을 5.0㎖이내가 되도록 감압농축 후 분액깔때기에 옮긴 후 증류수로 약 100㎖로 한 후 Hexane 100㎖ 첨가하여 2회 추출하였으며, 이후 전처리 과정은 식약청의 방법을 준용하였다. HPLC는 형광검출기(FLD)가 부착된 agilent 사의 1100 series를 이용하여 분석하였으며, 분석조건은 다음과 같다. HPLC 분석조건은 C18 column(Ace RP-18 column, 4.6×250㎜, 5㎛, shimadzu Co, Japan)을 사용하였고, Column 온도는 40℃로 하였으며, 검출기는 FLD(Exλ: 294㎚, Emλ: 404㎚)를 사용하였다. 이 동상은 A를 water, B를 Acetonitrile 용매로 A:B 초기 비율을 30:70으로 시작하여 5분까지 30:70, 10분에 20:80, 15분에 20:80, 20분에 15:85, 85분에 15:85, 26분 30:70 용매 조성으로 gradient system을 사용하였다. 유속은 1.0 ㎖/min이었으며, 시료는 10㎕를 주입하여 분석하였다.

모든 실험은 3회 이상 반복 측정하여 평균과 표준편차로 나타내었으며 그 결과는 SPSS 20.0 software package (Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)의 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 실시하여 유의성을 검토하였다.

폴리페놀은 식물의 2차 대사산물로 한 분자 내에 2개 이상의 phenolics hydroxyl기를 가진 방향족 화합물로 자연계에 널리 분포되어 있는 물질로서 특히 차입에 다량 포함되어 다양한 생리활성을 나타내는 물질로 알려져 있다[25]. 생리활성으로는 DNA보호, 세포구성 단백질 및 효소 보호, 항자외선, 항산화, 항암, 항 당뇨병, 항 골다공증 및 심장 질환예방에 효과가 있는 것으로 알려져 있다[26].

생마늘의 처리온도와 시간에 따른 총 폴리페놀 함량의 변화는 Fig1과 같다. 처리조건에 따른 총 폴리페놀 함량은 3.40mg/g ~ 9.97㎎/g으로 나타났다. 가장 높은 폴리페놀 함량을 보인 처리방법은 130℃, 12시간에서 9.97mg/g로 대조구인 생마늘에 비하여 약 4.4배 증가함을 보였다. 권 등[27] 은 호남에서 생산된 깐 마늘의 수용성 페놀화합물은 17.11㎎/g으로 보고 하였으며, 신 등[28] 남해마늘의 수용성 페놀화합물은 24.05㎎/g으로 보고 하였는데, 이러한 차이가 보이는 것은 시료의 제조방법과 산지별 차이에서 기인된 것으로 판단된다.

마늘의 처리조건에 따라서 110℃, 120℃ 및 130℃의 처리조건에서는 처리시간에 따라 수용성 페놀화합물이 증가하다가 특정시간 이후 감소하는 경향을 보였다. 이와 같은 결과는 권 등[27]의 연구결과와 유사한 결과로 나타났다.

마늘의 고온처리조건에 시간에 따라 증가와 감소가 나타나는 것은 특정온도에서 특정시간까지는 마늘에 존재하는 여러 화합물들이 고온처리에 의하여 페놀화합물로 전환되어 졌거나, 고온처리로 인하여 페놀화합물의 추출이 용이하게 변하여 함량이 증가하였을 것으로 판단된다. 그러나 마늘을 고온처리 조건에서 특정시간이상 처리 할 경우 폴리페놀의 함량이 감소하는 것은 비수용성 화합물로 전환되어 감소된 것으로 료되나 이에 대한 연구는 향후에 좀 더 깊이 있는 연구가 진행되어야 할 것으로 판단된다.

폴리페놀의 함량은 마늘의 처리온도와 시간의 변수에 대하여 유의적으로 영향을 받는 것으로 나타났으며(p<0.001), 처리온도에 따른 F-값은 140.32이고 처리시간의 F-값은 9.91로 나타나 처리 온도가 시간보다 더 많은 영향을 받는 것으로 나타났다.

마늘에 존재하는 다량의 유기 황 화합물은 다양한 효능을 가지고 있는 반면에 마늘이 가지는 독특한 향과 매운맛을 유발하는 물질로써 식용함에 있어 선호도를 저하 시킬 뿐 아니라 마늘을 이용한 식품개발에도 걸림돌이 되고 있다. 이와 같이 마늘이 가지는 독특한 향과 매운 맛을 감소시키는 연구는 많이 진행 되어왔다.

생마늘의 처리온도와 시간에 다른 환원당의 변화는 Fig 2에 나타내었다. 생마늘의 환원당은 10.94㎎/g으로 나타났으며, 고온 처리방법에 따른 환원당은 10.81㎎/g ~ 39.53㎎/g로 대조구인 생마늘에 비하여 약 4배 증가한 값을 보였다.

가장 높은 함량을 보인 처리방법은 110℃, 24시간에서 39.53㎎/g 로 나타났다. 이와 같은 결과는 Choi 등[29]은 흑 마늘의 항산화활성연구에서 환원당의 함량이 40㎎/g 으로 나타났다고 보고와 일치하는 결과를 나타내었다.

마늘의 처리조건에 따라서 110℃, 120℃ 및 130℃의 처리조건에서는 처리시간에 따라 환원당의 함량이 증가하다가 특정시간 이후 감소하는 경향을 보였다. 환원당의 함량이 특정온도에서 시간에 따라 증가한 것은 Park[30]이 보고한 마늘의 저장당류는 fructan으로 합성하여 저장한 당이 하고 발효과정 중 가수분해 되어 저분자의 유리당을 생성한다고 보고한 것과 같이 고온처리과정에서 다당류가 분해되어 환원당 함량이 늘어난 것으로 추정해 볼 수 있다. 처리 시간의 증가에 따라 환원당의 감소는 유리당이 처리시간의 증가에 따라 알돌축합반응으로 고분자물질의 생성과당의 알데하이드와 아민 중합반응 및 헤테로고리질소화합물로 전환되어 감소하였다고 볼 수 있으나 이에 대한 연구는 향후에 좀 더 깊이 있는 연구가 진행되어야 할 것으로 판단된다.

고온처리과정중 생성된 당 함량의 증가는 흑 마늘의 감미를 상승시켜 소비자들의 선호도를 높일 수 있을 것으로 사료된다.

환원당의 함량의 변화를 마늘의 처리온도와 시간의 변수에 대하여 조사한 결과 처리온도에는 유의적으로 영향을 받는 것으로 나타났으며(p <0.001), F-값은 34.84이었다. 처리시간에는 영향이 유의적 영향을 받지 않는 것으로 나타났으며(p >0.05). F-값은 0.31로 나타났다.

플라보노이드는 비타민 P라고 불리는 물질로 식물의 2차 대사산물이다. 우리 주변에서는 콩, 견과류 곡물 및 식물에서 발견되는 물질로, 신체 내에서 항 알레르기[31], 항염증[31][32], 항산화물질[32] 항균[33,34] 항 진균[35]. 항바이러스, 및 항 암[31,36] 설사방지 활성[37] 등의 광범위한 생물학적 및 약리학적 활성을 갖는 것으로 알려져 있다.

생마늘 과 고온 처리한 흑마늘 플라보노이드의 함량을 측정하였으며 그 결과는 Fig 3 와 같다. Fig 3에서 보는 봐와 같이 총 플라보노이드 함량은 생마늘이 0.078㎎/g 이었으나, 처리방법에 따른 플라보노이드의 함량은 0.08㎎/g ~ 2.82㎎/g으로 나타났으며, 이와 같은 결과는 생마늘에 비하여 약 36배 증가한 값을 보인다. 가장 높은 함량을 보인 처리방법은 130℃, 12시간에서 2.82㎎/g로 나타났다. 이와 같은 결과는 권 등[28]의 보고에 의하면 플라보노이드는 150℃, 1시간 처리 구에서 0.53㎎/g으로 나타났다고 보고하였는데. 본 연구와는 차이가 있는 것으로 나타났다. 이러한 차이가 보이는것은 시료의 제조방법과 산지별 차이에서 기인된것으로 판단된다. 처리온도 110℃에서는 시간이 길어짐에 따라 플라보노이드의 농도가 증가 하는 것으로 나타났으며, 처리온도 120℃, 130℃에서는 특 정시간이 지난 후 감소하는 결과를 보였으며, 이와 같은 결과는 권 등[27]의 연구결과와 유사한 결과로 나타났다. 유리 플라보노이드의 농도가 크게 증가 하는 것은 마늘의 고온처리로 인하여 세포막이나 다른 물질과 결합되어 있던 플라보노이드 화합물이 추출이 용이하게 변하여 함량이 증가하였을 것으로 판단된다. 또한 마늘을 고온처리 조건에서 특정시간이상 처리 할 경우 플라보노이드의 함량이 감소하는 것은 유리플라보노이드가 다른 화합물로 전환되어 감소된 것으로 사료되나 이에 대한 연구는 향후에 좀 더 깊이 있는 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.

플라보노이드의 함량은 마늘의 처리온도와 시간의 변수에 대하여 유의적으로 영향을 받는 것으로 나타났으며(p < 0.001), 처리온도에 따른 F-값은 223.6이고 처리시간의 F-값은 18.68로 나타나 처리온도가 시간보다 더 많은 영향을 받는 것으로 나타났다.

아질산염은 시안화물 중독 치료에 매우 효과적인 약품으로 WHO 필수 의약품 목록에 등재되어있는 물질이다. 또한 식품 첨가물로 육류의 지질의 산화방지 및 미생물 증식역제효과로 인하여 육류 산업에 널리 사용되고 있으나, 아질산염은 아민을 함유하고 있는 음식물을 섭취했을 때 발암성 물질인 니트로사민이 생성될 가능성이 매우 높은 것으로 알려져 있다. 이러한 니트로사민 생성반응은 nitrite와 반응할 수 있는 화합물에 의해 억제될 수 있는데 대표적인 물질들로는 비타민 C, 토코페롤, 페놀화합물 등 이 있다[38,39]. Kato 등[40]은 아질산염 소거능이 있는 물질은 phenol성 화합물, melanoidin이 관여하는 것으로 보고하였으며, Cooney와 Ross[41]는 phenolics, guaiacol, resorcinol 등의 페놀화합물은 nitroso화 반응을 강력하게 억제한다고 보고하였다.

아질산염 제거능력을 평가하기 위하여 수용성 페놀화합물이 가장 많이 생성하는 130℃ 12시간 처리한 물질과 대조구로 생마늘의 아질산염 제거능력을 조사하였으며, 그 결과는 Fig 4와 같이 나타났다. Fig 4에서 보듯이 생마늘과 흑 마늘 추출물에서 아질산염 제거능력의 경우 시료 농도가 증가할수록 아질산염 제거능력이 증가하는 것으로 나타났으며, 제거효율이 5㎎/㎖ 일 때 86%로 매우 높게 나타내고 있다. 이와 같은 결과는 ascorbic acid, 페놀화합물 및 allyl 화합물 등이 다량 함유된 식품일수록 아질산염의 소거작용이 우수하다는 Kang 등[42]의 연구결과와 유사하였다.

이와 같이 마늘 및 흑마늘의 아질산염의 소거작용이 뛰어난 것은 마늘에 존재하는 페놀화합물, allyl 화합물 및 마늘의 고온처리과정에서 형성되는 갈변물질 등에 기인한 효과로 사료된다.

벤조피렌(benzo[a]pyrene)은 다환 방향족탄화수소(PAHs)의 한 종류로 체내에 유입되면 산화되어 독성을 나타내며, 장기 노출 시 폐암, 위암, 피부암, 췌장암, 대장암, 유방암 등을 유발할 수 있어 WHO/IARC에서는 벤조피렌을 Group 1(인체 발암물질)로 분류하고 있다. 이와 같이 유해한 벤조피렌은 다환 방향족탄화수소(PAHs)의 일종으로 식품을 조리시간, 조리온도, 전구물질 등 PAHs 생성에 영향을 미치는 요인들은 다양하다. 앞의 생성요인 중 조리온도가 PAHs 생성에 가장 큰 영향을 미치는 요인으로 알려져 있으며 이에 대한 많은 연구가 진행되었다.

마늘의 고온처리를 통한 흑 마늘의 제조에 있어서 벤조피렌이 생성되었는지를 HPLCFLD를 통하여 조사하였다. 조사한 결과 벤조피렌은 검출되지 않았다. 그러나 처리온도와 시간에 따른 수용성페놀화합물의 감소, 환원당의 감소, 및 플라보노이드의 감소하는 경향을 보였음으로 다른 PAHs로의 전환도 의심할 수 있음으로 추후 연구에서 고온처리 흑 마늘의 안정성을 확보하기 위하여 보다 더 상세한 연구가 필요 할 것으로 사료된다.

마늘의 고온 처리의 변수인 온도와 시간에 따른 총 폴리페놀, 환원당 및 총 플라보노이드 간의 상관관계를 분석한 결과는 Table 1와 같다.

폴리페놀과 플라보노이드는 정적인 상관관계를 보였으며, 유의확률 또한 높게 나타난 반면 폴리페놀과 환원당은 정적인 상관관계에 있으나 유의적이지 않았다. 플라보노이드와 환원당은 부적인 상관관계를 보였으며, 유의적이지 않은 것으로 나타났다.